醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)/基因轉(zhuǎn)移方法
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(1)特異正常基因的分離與克?。簯?yīng)用重組DNA和分子克隆技術(shù)結(jié)合基因定位研究成果,已有不少基因并將會有更多人類基因被分離和克隆,這是基因治療的前提,在當代分子生物技術(shù)條件下,一般來說,只要有基因探針和準確的基因定位,任何基因都可被克隆。除此,現(xiàn)在既可人工合成DNA探針,還可用DNA合成儀在體外人工合成基因,這些都是在基因治療前,分離克隆特異基因的有利條件。
(2)外源基因的轉(zhuǎn)移:基因轉(zhuǎn)移(gene transfer)是將外源基因?qū)爰毎麅?nèi),其轉(zhuǎn)移方法較多,常用的要有下列幾類:
1)化學(xué)法:將正?;駾NA(及其拷貝)與帶電荷物質(zhì)和磷酸鈣、DEAE-葡萄糖或與若干脂類混合,形成沉淀的DNA微細顆粒,直接傾入培養(yǎng)基中與細胞接觸,由于鈣離子有促進DNA透過細胞有作用,某些化合物可擾亂細胞膜,故可將DNA輸入細胞內(nèi),并整合于受體細胞的基因組中,在適當?shù)臈l件下,整合基因得以表達,細胞亦可傳代。這種方法簡單,但效率極低,一般1000-100000個細胞中只有一個細胞可結(jié)合導(dǎo)入的外源基因。要達到治療目的,就需要從病人獲得大量所需的受體細胞。當然,可以通過選擇培養(yǎng)的方法來提高轉(zhuǎn)化率。
①電穿孔法:電穿孔法(electroporotion)是將細胞置于高壓脈沖電場中,通過電擊使細胞產(chǎn)生可逆性的穿孔,周圍基質(zhì)中的DNA可滲進細胞,但有時也會使細胞受到嚴重損傷。
②顯微注射法:顯微注射(microinjection)是在顯微鏡直視下,向細胞核內(nèi)直接注射外源基因,這種方法應(yīng)是有效的。但一次只能注射一個細胞,工作耗力費時。此法用于生殖細胞時,有效率可達10%。直接用于體細胞卻很困難。在動物實驗中,應(yīng)用這種方法將目的基因注入生殖細胞,使之表達而傳代,這樣的動物就稱為轉(zhuǎn)基因動物,目前成功使用得較多的是轉(zhuǎn)基因小鼠(transgenic mice),它可作為繁殖大量后代的疾病動物模型。
③脂質(zhì)體法:脂質(zhì)體(liposome)法是應(yīng)用人工脂質(zhì)體包裝外源基因,再與靶細胞融合,或直接注入病灶組織,使之表達。
3)同源重組法:同源重組(homologous recombination)是將外源基因定位導(dǎo)入受體細胞的染色體上,在該座位因有同源序列,通過單一或雙交換,新基因片段替換有缺陷的片段,達到修正缺陷基因的目的。如在新基因片段旁組裝一Neo基因,則在同源重組后,因有Neo基因,可在含有新霉素(neomycin)的培養(yǎng)基中生長,從而使未插入新基因片段的細胞死亡。對于體細胞基因治療,體外培養(yǎng)細胞的時間不能過長,篩選量大,故在臨床上應(yīng)用也受限制難以進行。今后如能改進技術(shù),提高重組率,這種定點修正基因的方法仍是有前景的。
4)病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移:前述的化學(xué)和物理方法都是通過傳染方式基因轉(zhuǎn)移。病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移(viral mediatedgene transfer)是通過轉(zhuǎn)換方式完成基因轉(zhuǎn)移,即以病毒為載體(vector),將外源目的基因通過基因重組技術(shù),將其組裝于病毒上,讓這種重組病毒去感染受體宿主細胞,這種病毒稱為病毒運載體(viral vector)。目前應(yīng)用的有兩種病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移方法。
①反轉(zhuǎn)錄病毒載體:反轉(zhuǎn)錄病毒雖是RNA病毒,但有反轉(zhuǎn)錄酶,可使RNA轉(zhuǎn)錄為DNA,再整合到宿主細胞基因組。反轉(zhuǎn)錄病毒載體有以下的優(yōu)點首先是具有穿透細胞的能力,可使近100%的受體細胞被感染,轉(zhuǎn)化細胞效率高;其次,它能感染廣譜動物物種和細胞類型而無嚴格的組織特異性;再者隨機整俁的病毒可長期存留,一般無害于細胞,但也存在缺點:這種載體只能把其DNA整合到能旺盛分裂細胞的染色體,而不適合于那些不能正常分裂的細胞,如神經(jīng)元。最嚴重的問題是由于病毒自身含有病毒蛋白及癌基因,就有使宿主細胞感染病毒和致癌的危險性。因此,人們有目的地將病毒基因及其癌基因除去,僅留它們的外殼蛋白,以保留其穿透細胞的功能,試圖避免上述缺點。這種改造后的病毒稱為缺陷型病毒(defective virus)。這樣的病毒中的反轉(zhuǎn)錄酶可將RNA轉(zhuǎn)化為DNA,有助于該DNA順利進入宿主細胞的基因組,而該病毒則死亡。由于病毒整合基因組是隨機的,所以還是可能激活細胞的原癌基因,以及因隨機插入發(fā)生插入突變。
在反轉(zhuǎn)錄病毒載體中,最常用于人類的是莫洛尼(Mooney)鼠白血病病毒(murine leukemia virus;Mo-MLV),其人工構(gòu)建的結(jié)構(gòu)如圖14-1。
②DNA病毒介導(dǎo)載體(DNA viral mekiated vector):DNA病毒包括腺病毒、SV40、牛乳頭瘤病毒、皰疹病毒等,一般認為這類病毒難于改造成缺陷型病毒,實用意義不大,但
圖14-1 Mo-MLV結(jié)構(gòu)示意圖
LTR:長末端重復(fù)序列,內(nèi)含啟動子、增強子及有關(guān)調(diào)節(jié)順序;gag:病毒核心抗原基因;
env:病毒外殼蛋白基因;pol:反轉(zhuǎn)錄酶基因
牛乳頭瘤病毒重組后,可不插入宿主染色體中引起插入突變,又可在宿主染色體外獨立復(fù)制,并表達出基因產(chǎn)物。有人發(fā)現(xiàn),因缺少E1區(qū)而致復(fù)制缺陷的腺病毒,可在表達E1基因的細胞中繁殖。后來證明,載有外源DNA的復(fù)制缺陷腺病毒呈現(xiàn)相同繁殖的特點。1993年法等國成功采用腺病毒載體進行心、腦、肺、肝內(nèi)膽管和肌肉組織的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移。它代表了基因治療的新方向。圖14-2是人的外源基因包裝在缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒中,感染細胞經(jīng)培養(yǎng)后再輸入病人進行治療的模式圖。
圖14-2 人的外源基因包裝在缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒中感染細胞
經(jīng)培養(yǎng)后再輸入病人體內(nèi)進行治療模式圖
最近,美國設(shè)計了一個的腺病癥載體(圖14-3),它是用一個化學(xué)連接器即賴氨酸鏈(lysine chain)將DNA栓在病毒外殼上,這樣組成的運輸器,通過一個表面抗體而進入細胞核,使宿主基因與治療基因共同表達。這個新病毒載體稱為腺病毒多賴氨酸DNA復(fù)合體(adeno virus-polylysine DNA-complex)。
圖14-3 腺病毒賴氨酸DNA復(fù)合體
采用復(fù)制缺陷的腺病毒進行基因治療有以下優(yōu)點:①該病毒可感染分裂和非分裂的細胞,并能得到大量基因產(chǎn)物,對神經(jīng)細胞、心肌細胞等基因缺陷的糾正有特殊意義;②病毒顆粒相對穩(wěn)定,并易于純化和濃縮,且感染力不降低;③可有效轉(zhuǎn)導(dǎo)多種靶細胞后而少游離于細胞基因組外,并持續(xù)表達;④已用于基因治療的Ad5屬腺病毒C亞群,無致癌性。前述的新腺病毒載體還有一大優(yōu)點是可以成功地運載48000bp的基因,而其它病毒只能運輸70 00bp的基因。這些優(yōu)點顯示了腺病毒介導(dǎo)載體的廣闊應(yīng)用前景。
基因治療的方法 | 靶細胞 |
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