腺病毒
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腺病毒(adenovirus)是一種沒(méi)有包膜的直徑為70～90 nm的顆粒，由252個(gè)殼粒呈廿面體排列構(gòu)成。每個(gè)殼粒的直徑為7～9 nm。衣殼里是線狀雙鏈DNA分子，約含35 000 bp，兩端各有長(zhǎng)約100 bp的反向重復(fù)序列。由于每條DNA鏈的5'端同相對(duì)分子質(zhì)量為55X103Da的蛋白質(zhì)分子共價(jià)結(jié)合，可以出現(xiàn)雙鏈DNA的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。
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腺病毒簡(jiǎn)介
人體腺病毒已知有33種，分別命名為adl～ad33，研究得最詳細(xì)是ad2。腺病毒基因組轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA，已知的轉(zhuǎn)錄單位至少有5個(gè)：EⅠ區(qū)位于病毒基因組左側(cè)，可再分成EⅠA和EⅠB，與細(xì)胞轉(zhuǎn)化有關(guān)；EⅡ區(qū)編碼DNA結(jié)合蛋白，參與病毒的復(fù)制；EⅢ區(qū)編碼出現(xiàn)在宿主細(xì)胞表面的一種糖蛋白；EⅣ區(qū)位于ad2基因組右端，受EⅡ區(qū)編碼的DNA結(jié)合蛋白質(zhì)調(diào)控；第5個(gè)轉(zhuǎn)錄單位在病毒感染中期合成ad2蛋白質(zhì)Ⅳ。
腺病毒對(duì)嚙齒類(lèi)動(dòng)物有致癌能力，或能轉(zhuǎn)化體外培養(yǎng)的嚙齒類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞。使細(xì)胞轉(zhuǎn)化只需要腺病毒基因組的一部分，這些基因位于基因組的左端，約占整個(gè)基因組的7％～10％。盡管腺病毒分布很廣，但對(duì)人體不出現(xiàn)致癌性。人體細(xì)胞是一類(lèi)允許細(xì)胞(permissive cell)，即這類(lèi)細(xì)胞允許感染入侵的病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖，最后細(xì)胞裂解死亡而釋放出大量子代病毒。在體外培養(yǎng)的多種人體腫瘤細(xì)胞中均未查出腺病毒顆粒，但在人的1號(hào)染色體上有adl2的整合位點(diǎn)，這意味著人體細(xì)胞對(duì)于腺病毒也可能是非允許細(xì)胞，即這類(lèi)細(xì)胞在病毒感染后，病毒不能在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖，但可整合在受感染細(xì)胞的基因組內(nèi)。這些細(xì)胞被病毒轉(zhuǎn)化，表型發(fā)生改變，且可在體外無(wú)限期地培養(yǎng)傳代。
腺病毒是一種無(wú)外殼的雙鏈DNA病毒，基因組長(zhǎng)約36kb，衣殼（capsid）呈規(guī)則的20面體結(jié)構(gòu)，直徑約80-110nm。衣殼含有240個(gè)聯(lián)體（hexon）、12個(gè)聯(lián)體（penton）及12根纖毛（fiber），除此之外還有其他一些小蛋白，如VI、VIII、IX、IIIa和IVa2等。六聯(lián)體是形成病毒衣殼20個(gè)三角形面的主要蛋白，12個(gè)頂端是5個(gè)聯(lián)體亞單位和3個(gè)纖毛蛋白構(gòu)成的復(fù)合物，12根纖毛以五聯(lián)體蛋白為基底由衣殼表面伸出，纖毛頂端形成頭節(jié)區(qū)（knob）。五聯(lián)體和纖毛的頭節(jié)區(qū)可與細(xì)胞表面的病毒受體結(jié)合，在病毒感染細(xì)胞過(guò)程中起著非常重要的作用。腺病毒的基因組以線性的雙鏈DNA形式存在，由蛋白VII和一種稱(chēng)為mu的小蛋白緊密地環(huán)繞在其周?chē)?，起到?lèi)組蛋白樣的作用。另一種蛋白V將這種DNA-蛋白復(fù)合物連接起來(lái)，并通過(guò)蛋白VI與病毒衣殼連接在一起。在兩條鏈的5′端各以共價(jià)鍵結(jié)合著一個(gè)被稱(chēng)為DNA末端蛋白（pTP）復(fù)合物（DNA-TPC）的特化的結(jié)構(gòu)，與腺病毒復(fù)制密切相關(guān)。腺病毒基因組的兩端各有一段100bp的反向末端重復(fù)序列（ITR），是復(fù)制的起始位點(diǎn)。在左端ITR的3′側(cè)有一段長(zhǎng)約300bp的包裝信號(hào)（ψ）介導(dǎo)腺病毒基因組包裝入病毒衣殼。對(duì)腺病毒而言，只有包括兩端的ITR和包裝信號(hào)（ψ）的約0.5kb的序列是順式作用元件，也就是說(shuō)必須由腺病毒載體自身攜帶，而其他的30余種蛋白都可以通過(guò)輔助病毒（或細(xì)胞）反式補(bǔ)足?！ ?/p>
腺病毒載體的優(yōu)點(diǎn)
1. 宿主范圍廣, 對(duì)人致病性低
腺病毒載體系統(tǒng)可廣泛用于人類(lèi)及非人類(lèi)蛋白的表達(dá)。腺病毒可感染一系列哺乳動(dòng)物細(xì)胞，因此在大多哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織中均可用來(lái)表達(dá)重組蛋白。特別需要指出的是：腺病毒具有嗜上皮細(xì)胞性，而人類(lèi)的大多數(shù)的腫瘤就是上皮細(xì)胞來(lái)源的。另外，腺病毒的復(fù)制基因和致病基因均已相當(dāng)清楚，在人群中早已流行（70-80%成人體內(nèi)都有腺病毒的中和抗體存在）。人類(lèi)感染野生型腺病毒后僅產(chǎn)生輕微的自限性癥狀，且病毒唑治療有效?！ ?/p>
2. 在增殖和非增殖細(xì)胞中感染和表達(dá)基因
逆轉(zhuǎn)錄病毒只能感染增殖性細(xì)胞，因此DNA轉(zhuǎn)染不能在非增殖細(xì)胞中進(jìn)行，而必須使細(xì)胞處于持續(xù)培養(yǎng)狀態(tài)。腺病毒則能感染幾乎所有的細(xì)胞類(lèi)型，除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤細(xì)胞。腺病毒是研究原代非增殖細(xì)胞基因表達(dá)的最佳系統(tǒng)，它可以使轉(zhuǎn)化細(xì)胞和原代細(xì)胞中得到的結(jié)果直接進(jìn)行對(duì)比?！ ?/p>
3. 能有效進(jìn)行增殖，滴度高
腺病毒系統(tǒng)可產(chǎn)生1010到1011VP/ml，濃縮后可達(dá)1013VP/ml，這一特點(diǎn)使它非常適用于基因治療。
4. 與人類(lèi)基因同源
腺病毒載體系統(tǒng)一般應(yīng)用人類(lèi)病毒作為載體，以人類(lèi)細(xì)胞作為宿主，因此為人類(lèi)蛋白進(jìn)行準(zhǔn)確的翻譯后加工和適當(dāng)?shù)恼郫B提供了一個(gè)理想的環(huán)境。大多數(shù)人類(lèi)蛋白都可達(dá)到高水平表達(dá)并且具有完全的功能?！ ?/p>
5. 不整合到染色體中，無(wú)插入致突變性
逆轉(zhuǎn)錄病毒可隨機(jī)整合到宿主染色體，導(dǎo)致基因失活或激活癌基因。而腺病毒則除了卵細(xì)胞以外幾乎在所有已知細(xì)胞中都不整合到染色體中，因此不會(huì)干擾其它的宿主基因。在卵細(xì)胞中整合單拷貝病毒則是產(chǎn)生具有特定特征的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的一個(gè)較好的系統(tǒng)。
6. 能在懸浮培養(yǎng)液中擴(kuò)增
293細(xì)胞可以適應(yīng)懸浮培養(yǎng)，這一調(diào)整可使病毒大量擴(kuò)增。大量事實(shí)證明懸浮293細(xì)胞可在1～20L的生物反應(yīng)器中表達(dá)重組蛋白?！ ?/p>
7. 能同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因
這是第一個(gè)可以在同一細(xì)胞株或組織中用來(lái)設(shè)計(jì)表達(dá)多個(gè)基因的表達(dá)系統(tǒng)。最簡(jiǎn)單的方法是將含有兩個(gè)基因的雙表達(dá)盒插入腺病毒轉(zhuǎn)移載體中，或者用不同的重組病毒共轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞株來(lái)分別表達(dá)一個(gè)蛋白。測(cè)定不同重組病毒的MOI比值可正確估計(jì)各重組蛋白的相對(duì)共表達(dá)情況。
正是由于具有以上一些優(yōu)點(diǎn)，腺病毒被極其廣泛地應(yīng)用于體外基因轉(zhuǎn)導(dǎo)、體內(nèi)接種疫苗、和基因治療等各個(gè)領(lǐng)域?！ ?/p>
分類(lèi)及致病性
分類(lèi)及自上個(gè)世紀(jì)50年代發(fā)現(xiàn)并成功分離腺病毒以來(lái)，已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了100余個(gè)血清型，其中人腺病毒有47種，分為A、B、C、D、E和F六個(gè)亞群（subgroup）?；蛑委煶Ｓ玫娜说?型及5型腺病毒在血清學(xué)分類(lèi)上均屬C亞群，在DNA序列上有95%的同源性。二者的增殖能力非常強(qiáng)，滴度通?？梢赃_(dá)到109pfu (plaque forming unit)/ml，其在單個(gè)細(xì)胞中的基因組拷貝數(shù)可達(dá)104（約占細(xì)胞總DNA的10%）。病毒顆粒比較穩(wěn)定，通過(guò)CsCl梯度離心可以達(dá)到1010~1011pfu/ml，滿足動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的要求。
2型和5型腺病毒的致病性主要表現(xiàn)為可以導(dǎo)致兒童上呼吸道感染。在感染的最初幾天，由于病毒大量復(fù)制和釋放，會(huì)出現(xiàn)中度發(fā)熱、渾身酸痛、乏力、咽痛等癥狀。但這些癥狀通常是比較短暫而輕微的，在以后的幾天里，會(huì)隨著中和抗體的產(chǎn)生而逐漸消失。雖然可以說(shuō)高滴度和高免疫原性是腺病毒的主要特點(diǎn)，但也是相對(duì)的，如8型腺病毒（主要感染小腸和結(jié)膜組織）可以在扁桃體等淋巴組織中潛伏下來(lái)。在C亞群的其他一些腺病毒中也可以見(jiàn)到同樣的現(xiàn)象，這是因?yàn)椴《镜腅3區(qū)編碼的功能可使其逃避宿主的免疫打擊。這似乎有助于理解為何腺病毒載體在造血系細(xì)胞中的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率明顯低于其他組織、細(xì)胞。
腺病毒的生活周期
腺病毒的生活周期可以分為兩個(gè)截然不同卻又不能割裂開(kāi)來(lái)的兩個(gè)階段。第一階段包括腺病毒顆粒粘附和進(jìn)入宿主細(xì)胞，將基因組釋放到宿主細(xì)胞核中，以及有選擇性地轉(zhuǎn)錄和翻譯早期基因。在這個(gè)階段，細(xì)胞為病毒基因組復(fù)制和腺病毒晚期基因表達(dá)并最終釋放成熟的感染顆粒，即第二階段，作好了準(zhǔn)備。第一階段將在6~8個(gè)小時(shí)內(nèi)完成，第二階段則更快，只需4~6個(gè)小時(shí)?！ ?/p>
粘附和進(jìn)入細(xì)胞
腺病毒感染細(xì)胞的過(guò)程是從腺病毒纖毛的頭節(jié)區(qū)粘附到細(xì)胞表面的特異性受體開(kāi)始的。因?yàn)槿讼俨《局饕c柯薩奇B病毒共用一種受體，因此這種受體被稱(chēng)為柯薩奇/腺病毒受體即CAR（coxsackie/adenovirus receptor）。接下來(lái)病毒纖毛基底部五鄰體表面的三肽RGD與細(xì)胞表面的αvβ3和αvβ5整合素結(jié)合，通過(guò)內(nèi)吞作用將腺病毒內(nèi)化到細(xì)胞中并進(jìn)入溶酶體。在溶酶體的酸性環(huán)境下，腺病毒衣殼的構(gòu)象將發(fā)生變化，被從溶酶體中釋放出來(lái)，躲過(guò)溶媒體的消化作用。最后，腺病毒顆粒轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，通過(guò)核孔將病毒DNA釋放到細(xì)胞核內(nèi)。相對(duì)于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，腺病毒基因組進(jìn)入細(xì)胞核是一個(gè)非常高效的過(guò)程，一般可以達(dá)到40%，前者雖然進(jìn)入胞質(zhì)的效率與后者相當(dāng)，而DNA進(jìn)入細(xì)胞核的效率卻只有前者的1/1000?！ ?/p>
轉(zhuǎn)錄與復(fù)制
一旦病毒基因組進(jìn)入細(xì)胞核，就將進(jìn)行一系列的復(fù)雜而有序的逐級(jí)放大的剪切和轉(zhuǎn)錄過(guò)程。一般的，以病毒DNA開(kāi)始復(fù)制為分界線，按轉(zhuǎn)錄時(shí)間的先后，將腺病毒基因大致區(qū)分為早期（E1~4）和晚期轉(zhuǎn)錄單位（L1~5）。各種腺病毒基因又可以進(jìn)一步地分為更小的轉(zhuǎn)錄單位，如E1區(qū)可以進(jìn)一步分為E1A和E1B，每個(gè)轉(zhuǎn)錄單位都至少有一個(gè)獨(dú)特的啟動(dòng)子。腺病毒基因組進(jìn)入細(xì)胞核后，細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子首先與E1A區(qū)上游的增強(qiáng)子結(jié)合，表達(dá)E1A蛋白，該蛋白的作用是調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝，使病毒DNA更易于在細(xì)胞中復(fù)制。E1A蛋白還可以激活其他早期基因（E1B、E2A、E2B、E3和E4）的啟動(dòng)子，其中E2B驅(qū)動(dòng)另外三個(gè)與病毒復(fù)制有關(guān)的早期基因轉(zhuǎn)錄單位末端蛋白前體（pTP, precursor terminal protein）、單鏈DNA結(jié)合蛋白（ssDBP, single-stranded DNA binding proteins）以及DNA聚合酶（DNA pol, DNA polymerase）的表達(dá)，這三個(gè)基因的表達(dá)產(chǎn)物緊密地結(jié)合成一個(gè)復(fù)合物，與至少三種細(xì)胞蛋白相互作用，啟動(dòng)病毒基因組的復(fù)制。
一般而言，DNA的復(fù)制是由RNA啟動(dòng)的，而在腺病毒卻是所謂的蛋白啟動(dòng)（protein-priming）。如前所述，腺病毒雙鏈DNA的每條單鏈的5′端有pTP蛋白結(jié)合，pTP通過(guò)其Ser-OH與DNA 5′端的dCMP 5′磷酸之間形成磷酸二脂鍵。腺病毒的DNA復(fù)制首先是以5′端結(jié)合有pTP的dCMP作為引物，以3′端的末端反向重復(fù)序列（ITR）為模板，進(jìn)行鏈置換（strand displacement）合成，置換出的單鏈分子可以自我退火環(huán)化，形成鍋柄樣環(huán)形分子，然后這種環(huán)形分子再以相同的機(jī)制合成出子代雙鏈DNA分子。
病毒基因組復(fù)制通常在感染后數(shù)小時(shí)開(kāi)始，同時(shí)早期基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯被關(guān)閉，晚期基因開(kāi)始表達(dá)。大部分的晚期基因的轉(zhuǎn)錄是以一個(gè)共同的主要晚期啟動(dòng)子（MLP, Major Late Promoter）調(diào)控的。實(shí)際上，MLP的活性與病毒基因組復(fù)制密切相關(guān)，有研究表明一旦腺病毒基因組開(kāi)始復(fù)制MLP的活性將明顯增強(qiáng)，對(duì)此我們將另外行文詳述。晚期基因主要編碼腺病毒的結(jié)構(gòu)蛋白。病毒結(jié)構(gòu)蛋白在細(xì)胞核內(nèi)聚集形成病毒衣殼，病毒的基因組被包裝進(jìn)去，形成有感染能力的病毒顆粒，并最終裂解宿主細(xì)胞被釋放出去，完成腺病毒的生活周期。腺病毒有明顯的種屬特異性，人的野生型5型腺病毒（wtAd
5）感染其他的非人類(lèi)細(xì)胞（如鼠類(lèi)細(xì)胞）后可以表達(dá)早期基因，基因組也可有一定程度的復(fù)制并能夠形成一些不成熟的病毒顆粒，卻不能形成成熟的病毒顆粒，也不能二次感染其他細(xì)胞?！ ?/p>
腺病毒基因產(chǎn)物的主要功能
E1區(qū)基因表達(dá)產(chǎn)物
可以進(jìn)一步分為E1A和E1B。E1A主要由兩種成分構(gòu)成，分別為289R（或13S）和243R（或12S）。這些E1A蛋白的主要功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝，使細(xì)胞對(duì)病毒復(fù)制更易感E1B19K與細(xì)胞Bcl-2基因的表達(dá)產(chǎn)物同源，可以通過(guò)滅活和清除Bax家族成員來(lái)防止細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死。E1B55K基因產(chǎn)物可以下調(diào)p53基因的轉(zhuǎn)錄水平，當(dāng)然這種調(diào)節(jié)功能不是絕對(duì)的，其他一些腺病毒基因（如E4 orf6）也參與了這一過(guò)程。另外，E1B55K基因產(chǎn)物還與病毒復(fù)制、病毒晚期mRNA的轉(zhuǎn)錄以及病毒RNA的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。
E2區(qū)基因表達(dá)產(chǎn)物
可分為E2A和E2B。其中，E2A即DNA結(jié)合蛋白（DBP，DNA Binding Protein）；E2B主要產(chǎn)物有兩種，分別是末端蛋白前體（pTP）和病毒DNA聚合酶（pol）。三種蛋白與至少三種細(xì)胞內(nèi)的因子相互作用，啟動(dòng)腺病毒DNA復(fù)制以及病毒晚期基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程?！ ?/p>
E3區(qū)基因表達(dá)產(chǎn)物
主要功能是破壞宿主的免疫防御機(jī)制，而與病毒基因組的復(fù)制無(wú)關(guān)。E3基因的產(chǎn)物之一11.6Kd，由于可以在病毒感染的晚期裂解細(xì)胞并釋放病毒顆粒而被稱(chēng)為腺病毒死亡蛋白（ADP，adenovirus death protein）。gp 19K蛋白可以在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上與MHC I類(lèi)分子的重鏈結(jié)合阻止其轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面，并且可以延緩MHC I的表達(dá)。RID α&β以及14.7Kd可以抑制由TNF誘發(fā)的細(xì)胞凋亡，促進(jìn)Fas降解，下調(diào)TNF受體水平?！ ?/p>
E4區(qū)基因表達(dá)產(chǎn)物
E4區(qū)的基因產(chǎn)物通常被稱(chēng)為orf 1~6/7，主要與病毒信使RNA的代謝有關(guān)。還有促進(jìn)病毒DNA復(fù)制以及關(guān)閉宿主蛋白合成的功能。研究發(fā)現(xiàn)，一些E4產(chǎn)物可以與DNA激活的蛋白激酶結(jié)合，防止病毒DNA發(fā)生串聯(lián)。由于該激酶可以激活p53基因，因此可以認(rèn)為一些E4區(qū)基因產(chǎn)物可以抑制細(xì)胞凋亡。許多E1B和E4基因產(chǎn)物都與拮抗E1A蛋白功能有關(guān)。比如，E4 orf4抑制E1A對(duì)E2F啟動(dòng)子的激活；E4 orf3VA RNA使一些由腺病毒轉(zhuǎn)錄的非翻譯RNA，與腺病毒抵抗宿主細(xì)胞免疫有關(guān)。
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