基因診斷與性病/核酸探針的種類
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DNA探針是最常用的核酸探針,指長度在幾百堿基對以上的雙鏈DNA或單鏈DNA探針。現(xiàn)已獲的DNA探針種類很多,有細(xì)菌、病毒、原蟲、真菌、動物和人類細(xì)胞DNA探針,這類探針多為某一基因的全部或部分序列,或某一非編碼序列。這些DNA片段須是特異的,如細(xì)菌的毒力因子基因探針和人類ALU探針,這些DNA探針的獲得有賴于分子克隆技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。以細(xì)菌為例,目前分子雜交技術(shù)用于細(xì)菌的分類和菌種鑒定比用G+C百分比值要準(zhǔn)確的多,是細(xì)菌分類學(xué)的一個發(fā)展方向,加之分子雜交技術(shù)的高度敏感性,分子雜交在臨床性病病原體診斷上具有廣泛的前景。
DNA探針(包括cDNA探針)有三大優(yōu)點:第一,這類探針多克隆在質(zhì)粒載體中,可以無限繁殖,取之不盡,制備方法簡便。其次,DNA探針不易降解(相對RNA而言),一般能有效抑制DNA酶活性。第三,DNA探針的標(biāo)記方法較成熟,有多種方法可供選擇,如缺口平移法、隨機(jī)引物法、PCR標(biāo)記法等,能用于同位素和非同位素標(biāo)記。
(二)cDNA探針
cDNA是指互補于mRNA的DNA分子(complementary DNA)。cDNA是由RNA經(jīng)一種稱為逆轉(zhuǎn)錄酶的DNA聚合酶催化產(chǎn)生的。攜帶逆轉(zhuǎn)錄酶的病毒侵入宿主細(xì)胞后,病毒RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下轉(zhuǎn)化成雙鏈cDNA,并進(jìn)而整合入宿主細(xì)胞染色體DNA分子,隨宿主細(xì)胞DNA復(fù)制同時復(fù)制,這種整合的病毒基因組稱為原病毒。在靜止?fàn)顟B(tài)下,可被復(fù)制多代,但不被表達(dá),故無毒性,一旦因某種因素刺激而被活化,則該病毒大量復(fù)制。如其帶有癌基因,還可能誘發(fā)細(xì)胞癌變。
逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)在已成為一項重要的分子生物學(xué)技術(shù),廣泛用于基因的克隆和表達(dá)。從逆轉(zhuǎn)錄病毒中提取的逆轉(zhuǎn)錄酶也已商品化。最常用的有AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。利用真核mRNA3′末端存在一段聚腺苷酸尾,可以合成一段寡聚胸苷酸用作引物,在逆轉(zhuǎn)錄酶催化下合成互補于mRNA的cDNA鏈,然后再用RNaseH將mRNA消化掉,再加入大腸桿菌DNA聚合酶I催化合成另一條DNA鏈,即完成了從mRNA到雙鏈DNA的逆轉(zhuǎn)錄過程。
所得到的雙鏈cDNA分子經(jīng)S1核酸酶切平兩端后接一個有限制酶切點的接頭(Adapter),再經(jīng)特定限制酶消化產(chǎn)生粘性末端,即可與含互補末端的載體進(jìn)行連接。常用的克隆載體是λ噬菌體DNA,如λgt、EMBL和Charon 系列等。用這類載體可以得到包含105以上轉(zhuǎn)化子文庫,再經(jīng)前面介紹的篩選方法篩選特定基因克隆。用這種技術(shù)獲得的DNA探針不含有內(nèi)含子序列。因此尤其適用于基因表達(dá)的檢測。
(三)RNA探針
RNA探針是一類很有前途的核酸探針,由于RNA是單鏈分子,所以它與靶序列的雜交反應(yīng)效率極高。早期采用的RNA探針是細(xì)胞mRNA探針和病毒RNA探針,這些RNA是在細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄或病毒復(fù)制過程中得到標(biāo)記的,標(biāo)記效率往往不高,且受多種因素的制約。這類RNA探針主要用于研究目的,而不是用于檢測。例如,在篩選逆轉(zhuǎn)錄病毒人類免疫缺陷病毒(HIV)的基因組DNA克隆時,因無DNA探針可利用,獲得HIV的全套標(biāo)記mRNA作為探針,成功地篩選到多株HIV基因組DNA克隆。
隨著體外逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)不斷完善,已成功的建立了單向和雙向體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。該系統(tǒng)主要基于一類新型載體PSP和PGEM,這類載體在多克隆位點兩側(cè)分別帶有SP6啟動子和T7啟動子,在SP6RNA聚合酶或T7RNA聚合酶作用下可進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)錄。如果在多克隆位點接頭中插入了外源DNA片段,則可以以DNA兩條鏈中的一條為模板轉(zhuǎn)錄生成RNA。這種體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)效率很高,在1小時內(nèi)可合成近10μg的RNA產(chǎn)物。只要在底物中加入適量的放射性或生物素標(biāo)記的dUTP,則所合成的RNA可得高效標(biāo)記。該方法能有效地控制探針的長度并可提高標(biāo)記分子的利用率。
RNA探針和cDNA探針具有DNA探針?biāo)荒鼙葦M的高雜交效率,但RNA探針也存在易于降解和標(biāo)記方法復(fù)雜等缺點。
(四)寡核苷酸探針
前述三種探針均是可克隆的,一般情況下,只要有克隆的探針,就不用寡核苷酸探針。在DNA序列未知而必須首先進(jìn)行克隆以便繪制酶譜和測序時,也常應(yīng)用克隆探針??寺√结樢话爿^寡核苷酸探針的特異性強(qiáng),復(fù)雜度也高,從統(tǒng)計學(xué)角度而言,較長的序列隨機(jī)碰撞互補序列的機(jī)會較短序列少??寺√结樀牧硪粌?yōu)點是,可獲得較強(qiáng)的雜交信號,因為克隆探針較寡核苷酸探針摻入的可檢測標(biāo)記基因更多。但是,較長的探針對于靶序列變異的識別能力又有所降低。對于僅是單個堿基或少數(shù)堿基不配的兩個序列,克隆探針不能區(qū)分,往往雜交信號相當(dāng)。這既是其優(yōu)點,又是其缺點,優(yōu)點是當(dāng)用于檢測病原微生物時,不會因病毒或細(xì)菌DNA的少許變異而漏診,缺點則是不能用于檢測突變點。這種情況,通常要采用化學(xué)合成的寡核苷酸探針。
合成的寡核苷酸探針具有以下特點:第一,由于鏈短,其序列復(fù)雜度低,分子量小,所以和等量靶位點完全雜交的時間比克隆探針短。第二,寡核苷酸探針可識別靶序列內(nèi)一個堿基的變化,因為短探針中堿基錯配能大幅度降低雜交體的Tm值。第三,一次可大量合成寡核苷酸探針,使得這種探針價格低廉,與克隆探針一樣,寡核苷酸探針能夠用酶學(xué)或化學(xué)方法修飾以進(jìn)行非放射性標(biāo)記物的標(biāo)記。最常用的寡核苷酸探針長18-40個鹼基,目前的合成可有效地合成至少50個堿基的探針。
對于合成的寡核苷酸探針有以下要求:
(1)長度以18-50堿基為宜,較長探針雜交時間較長,合成量也低;較短探針特異性較差。
(2)堿基成分:G+C含量為40%-60%,超出此范圍則會增加非特異雜交。
(3)探針分子內(nèi)不應(yīng)存在互補區(qū),否則會出現(xiàn)抑制探針雜交的“發(fā)夾”狀結(jié)構(gòu)。
(4)避免單一堿基的重復(fù)出現(xiàn)。
(5)一旦選定某一序列符合上述標(biāo)準(zhǔn),最好將該序列與核酸庫中的核酸序列比較,探針序列應(yīng)與靶序列核酸雜交,而與非靶區(qū)域的同源性不應(yīng)超過70%或有連續(xù)8個或更多的堿基的同源。否則,該探針不能用。
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