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臨床基礎(chǔ)檢驗(yàn)學(xué)

血液學(xué)檢查 血液一般檢查 儀器法血細(xì)胞檢查 電阻抗法血細(xì)胞分析儀測(cè)試原理 血細(xì)胞分析儀檢測(cè)參數(shù)的臨床意義 方法學(xué)評(píng)價(jià) 血細(xì)胞分析儀應(yīng)用進(jìn)展

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隨著高技術(shù)的引用和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，各種類(lèi)型的血液分析儀相繼問(wèn)世。其進(jìn)展主要表現(xiàn)在以下幾方面：

（一）儀器測(cè)試原理的改進(jìn)

這些儀器主要體現(xiàn)在白細(xì)胞分類(lèi)部分的改進(jìn)，即電阻抗法的三分群發(fā)展為多項(xiàng)技術(shù)聯(lián)合同時(shí)檢測(cè)一個(gè)細(xì)胞，綜合分格實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，得出的較為準(zhǔn)確的白細(xì)胞分群結(jié)果。迄今，世界上應(yīng)用的這類(lèi)儀器主要有以下四種類(lèi)型。

1．容量、電導(dǎo)、光散射（VCS）白細(xì)胞分類(lèi)法VCS(volume conductivity lightscantter)技術(shù)可使血細(xì)胞在未經(jīng)任何處理，與體內(nèi)形態(tài)完全相同的自然狀態(tài)下得出檢測(cè)結(jié)果。首先在標(biāo)本內(nèi)中入只作用于紅細(xì)胞的溶血劑使紅細(xì)胞溶解，然后加入抗溶血?jiǎng)?，起中和前述溶血?jiǎng)┑淖饔?，使白?xì)胞表面、胞質(zhì)及細(xì)胞大小等特征仍然保持與體內(nèi)時(shí)間相同的狀態(tài)。

根據(jù)流體力學(xué)的原理使用鞘流技術(shù)使溶血后液體內(nèi)剩余的白細(xì)胞單個(gè)通過(guò)檢測(cè)器，VCS三種技術(shù)的同時(shí)檢測(cè)，體積的測(cè)量使用的是電阻抗原理。電導(dǎo)性是根據(jù)細(xì)胞壁能產(chǎn)生高頻電流的性能，采用高頻電磁探針測(cè)量細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu) — 細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)的比例，細(xì)胞骨的化學(xué)成分，以此來(lái)幫助鑒別細(xì)胞。因此電導(dǎo)性可辨別體積完全相同的而性質(zhì)量同的兩個(gè)細(xì)胞群。如小淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞兩者直徑均為9-12μm，當(dāng)前高頻電流通過(guò)這兩種細(xì)胞時(shí)，由于他們的核與胞質(zhì)比例不同，而呈現(xiàn)出不同的信號(hào)，借此可把他們區(qū)分開(kāi)來(lái)，光散射（scatter,S）是除了體積和電導(dǎo)性以外，又從細(xì)胞表面光散射的特點(diǎn)提供細(xì)胞類(lèi)型的鑒別方式，來(lái)自激光光源的單色光束直接進(jìn)入計(jì)數(shù)池的敏感區(qū)，在10⁰-70⁰時(shí)對(duì)每一個(gè)細(xì)胞進(jìn)行掃描分析，提供細(xì)胞結(jié)構(gòu)、形態(tài)的光散射信息。光散射特別具有對(duì)細(xì)胞顆粒的構(gòu)型和顆粒質(zhì)量的區(qū)別能力。細(xì)胞粗顆粒挑散射要雙細(xì)顆粒更強(qiáng)，所以通過(guò)光散射可幫助儀器將粒細(xì)胞分開(kāi)。

根據(jù)以上三種方法檢測(cè)的數(shù)據(jù)，經(jīng)計(jì)算機(jī)處理得出細(xì)胞分布圖（圖示-15）進(jìn)而計(jì)算出實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖中各圈內(nèi)的范圍均代表正常細(xì)胞和異常細(xì)胞在圖中可能出現(xiàn)的位置，數(shù)字代表細(xì)胞的類(lèi)型。

圖2-15 VCS法細(xì)胞分布圖

1．幼稚細(xì)胞　2．桿狀核粒細(xì)胞

3．單核細(xì)胞　4．單核細(xì)胞或淋巴細(xì)胞

5．淋巴細(xì)胞　6．變異淋巴細(xì)胞

7．小型非典型淋巴細(xì)胞　8．有核紅細(xì)胞

9．巨大血小板　10．血小板凝塊

2．阻抗與射頻技術(shù)聯(lián)合的白細(xì)胞分類(lèi)法這尖儀器白細(xì)胞計(jì)數(shù)通過(guò)四個(gè)不同檢測(cè)系統(tǒng)完成。

（1）嗜酸性粒細(xì)胞檢測(cè)系統(tǒng)：血液進(jìn)入儀器后，經(jīng)分血器使血液與嗜酸性粒細(xì)胞特異計(jì)數(shù)的溶血的劑混合，由于其特殊的PH，使除嗜酸性粒細(xì)胞以外的所有細(xì)胞溶解或萎縮，含有完整的嗜酸性粒細(xì)胞液體的通過(guò)小孔時(shí)，使計(jì)數(shù)電路產(chǎn)生脈沖而被子計(jì)數(shù)。

（2）嗜三性粒細(xì)胞檢測(cè)系統(tǒng)：計(jì)數(shù)原理與嗜酸性粒細(xì)胞相同，由于堿性溶血?jiǎng)┲荒鼙Ａ襞c血液中嗜堿性的粒細(xì)胞，因此根據(jù)脈沖的多少即可求得嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)。上述二種方法除需要使用專(zhuān)一的溶血?jiǎng)┩?，還需特定的作用溫度和時(shí)間。

（3）淋巴、單核、粒細(xì)胞（中性、嗜堿性、嗜酸性性）的檢測(cè)系統(tǒng)：這個(gè)系統(tǒng)采用電阻與射頻聯(lián)合檢測(cè)的方式。使用的溶血?jiǎng)┑淖饔幂^輕溶血?jiǎng)┐┩?a href="/w/%E7%BB%86%E8%83%9E%E8%86%9C" title="細(xì)胞膜">細(xì)胞膜時(shí)僅使少量的胞質(zhì)溢出，對(duì)核的皺縮作用也較輕微，細(xì)胞形態(tài)改變不大。在小孔的內(nèi)外電級(jí)上存有直流和高頻兩個(gè)放射器，在小孔周?chē)嬖谥绷麟娂吧漕l兩小及顆粒的多少。因此細(xì)胞進(jìn)入小孔時(shí)產(chǎn)生兩個(gè)不同的脈沖信號(hào)，脈站的高低分別代表細(xì)胞的大小和核及顆粒的密度，以DC信號(hào)為橫叢標(biāo)，RF為縱坐標(biāo)，就可根據(jù)2個(gè)信號(hào)把同一個(gè)細(xì)胞定位于二維的細(xì)胞散射圖上。由于淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及粒細(xì)胞的細(xì)胞大小、細(xì)胞質(zhì)含量，胞質(zhì)內(nèi)顆粒的大小與密度、細(xì)胞核的形態(tài)與密度不同，DC及EF的脈沖信號(hào)有較大的差異，定位在各自散射的區(qū)域，通過(guò)掃描技術(shù)得出各類(lèi)細(xì)胞比例（見(jiàn)圖2-16）。

圖2-16 電阻抗與射頻聯(lián)合檢測(cè)白細(xì)胞分布圖

（4）幼稚細(xì)胞檢測(cè)系統(tǒng)：此胞膜上脂質(zhì)較成熟細(xì)胞少的現(xiàn)象，在細(xì)胞懸液加入硫化氨基酸后，由于細(xì)胞上脂質(zhì)占位不同，故結(jié)合在幼稚細(xì)胞的硫化氨基酸較成熟的細(xì)胞多，且對(duì)溶血?jiǎng)┯械挚棺饔?。?dāng)加入溶血?jiǎng)┖螅墒旒?xì)胞被溶解，如果懸液中存在細(xì)胞細(xì)胞，其形態(tài)不受契約壞，因此可通過(guò)電阻抗的方法檢測(cè)出來(lái)。（圖2-17）。

圖2-17電阻抗與射頻聯(lián)合檢測(cè)白細(xì)胞、幼稚細(xì)胞、屏幕細(xì)胞分布圖

3．光散射與細(xì)胞化學(xué)技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用于白細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)：聯(lián)合應(yīng)用激光射的過(guò)氧化物酶染色技術(shù)來(lái)進(jìn)行白細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)。嗜酸性粒細(xì)胞有很強(qiáng)的過(guò)氧化物酶活性，中性粒細(xì)胞有較強(qiáng)的過(guò)氧化物酶活性，單細(xì)胞資助之，而淋巴細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞均無(wú)此酶。將血興高采烈經(jīng)過(guò)氧化物酶染色后，胞質(zhì)內(nèi)即可出現(xiàn)不同的酶化學(xué)反應(yīng)，由此構(gòu)成了此種血液分析儀的分析基礎(chǔ)，化妝品的分血器將血加入到含有清洗劑和甲醛的高滲液體內(nèi)（21倍稀釋?zhuān)┎⒎跤?0⁰～70⁰）20秒鐘。其中清洗劑（含有非離子表面活性劑）使細(xì)胞破壞，甲醛使白細(xì)胞質(zhì)內(nèi)酶被固定，此后發(fā)生第二步反應(yīng)，即加入過(guò)氧化氫和4氯=蔡酚，并加熱13秒，此時(shí)如果待測(cè)細(xì)胞質(zhì)中含有過(guò)氧化酶即可分解H₂O₂產(chǎn)生［O］，后者可使4氯-蔡酚顯色并沉積定位于酶反應(yīng)部位，此類(lèi)細(xì)胞通過(guò)測(cè)試區(qū)時(shí)，由于酶反應(yīng)強(qiáng)度不同（陰性、弱陽(yáng)性、強(qiáng)陽(yáng)性）和細(xì)胞體大小不同，激光束射互細(xì)胞上的前向角和散射角有所不同，以X軸為吸光率標(biāo)記（酶反應(yīng)強(qiáng)度），Y軸為光散射（細(xì)胞大小）。每個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生的兩個(gè)信號(hào)結(jié)合定位在細(xì)胞圖上（圖2-18）。每秒鐘儀器可測(cè)上千個(gè)細(xì)胞。計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)存儲(chǔ)的資料進(jìn)行分析處理，并結(jié)合嗜好堿性粒細(xì)胞或分葉核粒細(xì)胞通道結(jié)果計(jì)算出白細(xì)胞總參數(shù)和分類(lèi)良數(shù)。

圖2-18 激光與細(xì)胞化學(xué)聯(lián)合檢測(cè)白細(xì)胞直方示意圖

4．多角度偏振光散射白細(xì)胞分類(lèi)技術(shù)（multi — Angle polatised scatter separation of white cell,MAPSS）其原理是一定體積的全血標(biāo)本用鞘流液按適當(dāng)比例稀釋。其白細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)近似于自然狀態(tài)，因嗜堿性粒細(xì)胞嘌粒具有吸濕的特性，所以嗜堿性粒細(xì)胞的結(jié)構(gòu)有輕微改變。紅細(xì)胞內(nèi)部的滲透透壓高于鞘興高采烈的滲透壓而發(fā)生改變，紅細(xì)胞內(nèi)的血紅蛋白從細(xì)胞內(nèi)游離出來(lái)，而鞘液內(nèi)的水分進(jìn)入紅細(xì)胞中，細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)仍然完整，但此時(shí)的紅細(xì)胞折炮指數(shù)與鞘液的相同，故紅細(xì)胞不干擾白細(xì)胞檢測(cè)。

在水動(dòng)力系統(tǒng)的作用下，樣本被集中為一個(gè)直徑為30μm的小股液流，該液流將稀釋細(xì)胞單個(gè)排列，因是單個(gè)通過(guò)激光束，故在各個(gè)方向都有其散射光?？梢詮乃膫€(gè)角度測(cè)定散射光的密度（見(jiàn)圖2-19）：①0⁰：前角光散射（1⁰～3⁰）粗略地測(cè)定細(xì)胞大小；②10⁰：狹角光散射（7⁰～11⁰）測(cè)細(xì)胞結(jié)構(gòu)及其復(fù)雜性的相對(duì)特征；③90⁰：90⁰消偏振光散射（70⁰`～110⁰），基于顆?？梢詫⒋怪苯嵌鹊钠窦す庀竦奶匦裕瑢⑹人峒?xì)胞從中性粒細(xì)胞和其它細(xì)胞中分離出來(lái)。④90⁰：垂直光散射（70⁰～110⁰）主要對(duì)細(xì)胞內(nèi)部顆粒和細(xì)胞成分進(jìn)行測(cè)量?？梢詮倪@四個(gè)角度同時(shí)對(duì)個(gè)白細(xì)胞進(jìn)行測(cè)量，同一種特定的程序自動(dòng)儲(chǔ)存和分析數(shù)據(jù)，將白細(xì)胞分為嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞5種。

圖2-19 MAPSS測(cè)量原理

（二）儀器自動(dòng)化水平的提高

80年代以前，血細(xì)胞分析儀主動(dòng)脈要是半自動(dòng)型。此類(lèi)儀器需要將標(biāo)本經(jīng)機(jī)外預(yù)稀釋后才能檢測(cè)，惚受干擾，隨機(jī)誤差也很大。隨著全自動(dòng)型儀器不斷涌現(xiàn)，血液直接被入血細(xì)胞分析儀后的在機(jī)內(nèi)自動(dòng)稀釋、自動(dòng)加溶血?jiǎng)?、定時(shí)檢測(cè)，提高了儀器的精確度和準(zhǔn)確度。

最近，“聯(lián)合型血液分析系統(tǒng)‘問(wèn)世，這個(gè)系統(tǒng)將先進(jìn)的血細(xì)胞分析儀、涂片機(jī)、染色下、網(wǎng)織紅細(xì)胞儀串聯(lián)在一起。血液先經(jīng)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)，根據(jù)紅細(xì)胞情況決定是否做網(wǎng)織紅計(jì)數(shù)；根據(jù)HCT來(lái)改變推片機(jī)的角度和速度，以保證血涂片的合格。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和直方圖的變化，計(jì)算機(jī)選擇是否需要一步顯微鏡檢查。特別是自動(dòng)加樣系統(tǒng)和真空采血管的應(yīng)用。不但可能避免實(shí)驗(yàn)的隨機(jī)誤差，提高工作效率，而且可避免某些實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)造成的血行感染，對(duì)工作人員的勞動(dòng)保護(hù)起以關(guān)鍵作用，成為儀器發(fā)展和使用的潮流。

（三）各種特殊技術(shù)的應(yīng)用

為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確，不同儀器使用不同的特殊技術(shù)：①為了使細(xì)胞計(jì)數(shù)準(zhǔn)確采用“三次計(jì)數(shù)“表決；②采用熱敏電阻裝置，監(jiān)測(cè)試劑溫度；③為了使積壓小板計(jì)數(shù)準(zhǔn)確，采用流技術(shù)及鞘流；④為同避免小細(xì)胞和大血小板干擾血小板計(jì)數(shù)，采用浮動(dòng)界標(biāo)技術(shù)；⑤儀器自動(dòng)保護(hù)技術(shù)、采用了燃燒電路、管道和過(guò)樣針的自動(dòng)清洗及故障礙自檢功能；⑥各種方式的質(zhì)控制資料儲(chǔ)存和處理（比如X-B質(zhì)控法）。這些技術(shù)對(duì)于質(zhì)量控制起了關(guān)鍵作用。

以上介紹了近年來(lái)五分類(lèi)法血細(xì)胞分儀白細(xì)胞分類(lèi)的原理及臨床應(yīng)用價(jià)值。不難看出，由于高科技的應(yīng)用，使細(xì)胞分析更精確、更準(zhǔn)確，為臨床診斷與治療提供了重要依據(jù)，也大大提高了實(shí)驗(yàn)室工作效率。但應(yīng)指出，各類(lèi)儀器仍有其不足之處，如不能對(duì)單個(gè)細(xì)胞完全識(shí)別，特別是白血病細(xì)胞和正常單核細(xì)胞、異常不典型淋巴細(xì)胞，因?yàn)槲宸诸?lèi)法儀器的白細(xì)胞分類(lèi)只是嚴(yán)格根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果，必要時(shí)仍需以顯微鏡涂片檢查進(jìn)行復(fù)檢。

方法學(xué)評(píng)價(jià) | 血栓與止血的一般檢查

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