聚合酶鏈式反應
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聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction)，簡稱PCR，是一種分子生物學技術，用于放大特定的DNA片段?？煽醋魃矬w外的特殊DNA復制。
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PCR原理
DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子挎貝。在實驗中發(fā)現，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當溫度降低后又可以復性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復性，加入設計引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。
但是，DNA聚合酶在高溫時會失活，因此，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶，不僅操作煩瑣，而且價格昂貴，制約了PCR技術的應用和發(fā)展。
發(fā)現耐熱DNA聚合酶--Taq酶對于PCR的應用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環(huán)加酶，使PCR技術變得非常簡捷、同時也大大降低了成本，PCR技術得以大量應用，并逐步應用于臨床。
PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：
①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；
②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；
③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基互補配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈，重復循環(huán)變性--退火--延伸三過程就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。
PCR步驟
標準的PCR過程分為三步：
1.DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下， 氫鍵斷裂，形成單鏈DNA
2.退火（25℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。
3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。
每一循環(huán)經過變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。如圖所示：
現在有些PCR因為擴增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時間內復制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行，以減少一次升降溫過程，提高了反應速度。
PCR反應特點
（1）特異性強
PCR反應的特異性決定因素為：
①引物與模板DNA特異正確的結合；
②堿基配對原則；
③Taq DNA聚合酶合成反應的忠實性；
④靶基因的特異性與保守性。
其中引物與模板的正確結合是關鍵。引物與模板的結合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應的忠實性及TaqDNA聚合酶耐高溫性，使反應中模板與引物的結合(復性)可以在較高的溫度下進行，結合的特異性大大增加，被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。
（2）靈敏度高
PCR產物的生成量是以指數方式增加的，能將皮克(pg=10-12)量級的起始待測模板擴增到微克(μg=-6)水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位)；在細菌學中最小檢出率為3個細菌。
（3）簡便、快速
PCR反應用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應液加好后，即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應，一般在2～4 小時完成擴增反應。擴增產物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。
（4）對標本的純度要求低
不需要分離病毒或細菌及培養(yǎng)細胞，DNA 粗制品及RNA均可作為擴增模板?？芍苯佑门R床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等DNA擴增檢測。
PCR的循環(huán)參數
1、預變性（Initial denaturation）：模板DNA完全變性與PCR酶的完全激活對PCR能否成功至關重要，建議加熱時間參考試劑說明書，一般未修飾的Taq酶激活時間為兩分鐘?！?/p>
2、循環(huán)中的變性步驟：循環(huán)中一般95℃，30秒足以使各種靶DNA序列完全變性，可能的情況下可 縮短該步驟時間。變性時間過長損害酶活性，過短靶序列變性不徹底，易造成擴增失敗。
3、引物退火（Primer annealing）：退火溫度需要從多方面去決定，一般根據引物的Tm值為參考，根據擴增的長度適當下調作為退火溫度。然后在此次實驗基礎上做出預估。退火溫度對PCR的特異性有較大影響。
4、引物延伸：引物延伸一般在72℃進行（Taq酶最適溫度）。但在擴增長度較短且退火溫度較高時，本步驟可省略。延伸時間隨擴增片段長短而定，一般推薦在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生設定為1min/kbp。
5、循環(huán)數：大多數PCR含25-40循環(huán)，過多易產生非特異擴增。
6、最后延伸：在最后一個循環(huán)后，反應在72℃維持5-15分鐘．使引物延伸完全，并使單鏈產物退火成雙鏈。
PCR學習視頻
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