生物化學(xué)與分子生物學(xué)/噬菌體載體

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生物化學(xué)與分子生物學(xué)

DNA重組與基因工程
- 基因工程載體
  - 質(zhì)粒載體
  - 噬菌體載體
  - 動(dòng)物病毒載體

噬菌體（phage）是感染細(xì)菌的一類病毒，有的噬菌體基因組較大，加入λ噬菌和T噬菌體等；有的則較小，如M13、f1、fd噬菌體等。用感染大腸桿菌的λ噬菌體改造成的載體應(yīng)用最為廣泛。

λ噬菌體由頭和尾構(gòu)成，其基因組是長約49kb的線性雙鏈DNA 分子，組裝在頭部蛋白質(zhì)外殼內(nèi)部，其序列已被全部測(cè)出。λ噬菌體感染時(shí)，通過尾管將基因組DNA注入大腸桿菌，而將其蛋白質(zhì)外殼留在菌外。DNA進(jìn)入大腸桿菌后以其兩端12bp的互補(bǔ)單鏈粘末端環(huán)化成環(huán)狀雙鏈，可以兩種不同的方式繁殖（圖20-3）：①溶菌性方式（lyticpathway）：在營養(yǎng)充足，條件適合細(xì)菌繁殖時(shí)，利用宿主菌中的酶類和原料，λDNA上基因可按調(diào)控的順序表達(dá)合成構(gòu)成噬菌體頭、尾和尾絲所需的各種蛋白質(zhì)，λDNA經(jīng)多次復(fù)制合成許多子代λDNA，于是裝配成許多子代的λ噬菌體，最后裂菌，釋放出許多新的λ噬菌體。②溶原性方式（lysogenic pathway）：進(jìn)入細(xì)菌的λDNA可整合(integrate）入細(xì)菌的染色質(zhì)DNA中，隨細(xì)菌染色體DNA復(fù)制，傳給細(xì)菌后代，這個(gè)穩(wěn)定潛伏在細(xì)菌染色質(zhì)DNA中的λDNA稱為原噬菌體(prophage)，含有原噬菌體的細(xì)菌稱為溶源菌(lysogen)。λDNA的整合是可逆的，原噬菌體可從宿主DNA中切出，進(jìn)入溶菌性方式的繁殖。

λ噬菌體的溶菌和溶原繁殖方式

圖20-3　λ噬菌體的溶菌和溶原繁殖方式

λ噬菌體整個(gè)基因組如圖20-4所示，可分為三個(gè)部分，①左臂：從A到J長約20kb，其中的基因編碼構(gòu)成頭部、尾部、尾絲對(duì)組裝完整噬菌體所需要的蛋白質(zhì)。②中段：長約20kb，是λDNA整合和切出，溶原生長所需的序列。③右臂：長約10kb，是調(diào)控區(qū)，控制溶菌和溶原生長最重要的調(diào)控基因和序列、以及λDNA復(fù)制起始均在這區(qū)域內(nèi)。左右臂包含λDNA復(fù)制、噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白合成、組裝成熟噬菌體、溶菌生長所需全部序列；對(duì)溶菌生長來說，中段是非必需的。

利用λ噬菌體作載體，主要是將外來目的DNA替代或插入中段序列，使其隨左右臂一起包裝成噬菌體，去感染大腸桿菌，并隨噬菌體的溶菌繁殖而繁殖?，F(xiàn)在廣泛使用的λ噬菌體載體也是已作過許多人工改造的，主要的改造是：①設(shè)計(jì)去除λDNA上的一些限制性酶切點(diǎn)。這是因?yàn)棣薉NA較大，序列中的限制性酶切點(diǎn)過多，妨礙其應(yīng)用。②在中段非必需區(qū)，替換插入某些標(biāo)志基因如上述的可供藍(lán)白篩選lacI-lacZ’序列，和多克隆位點(diǎn)等。由此可構(gòu)建出兩類λ噬菌體作載體；一類是插入型載體，可將外來序列插中段，常用的λgt系列載體，一般容許插入5-7kb外來DNA；另一類是轉(zhuǎn)換型載體，即可用外來DNA替代中段，如IMBL系列載體。

野生型λ噬菌體DNA及相應(yīng)的λ噬菌體DNA圖譜

圖20-4　野生型λ噬菌體DNA及相應(yīng)的λ噬菌體DNA圖譜

插入或置換中段外來的DNA長度是有一定限制的，當(dāng)噬菌體DNA長度大于野生型λ噬菌體基因組105%或小于78%時(shí)，包裝而成的噬菌體存活力顯著下降。所以λ噬菌體載體可插入長5-20kb的外來DNA，這比質(zhì)粒載體能插入的DNA長得多；而且包裝的λ噬菌體感染大腸桿菌要比質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌的效率高得多，所以λ噬菌體載體常用于構(gòu)建cDNA文庫或基因組文庫。但λ噬菌體載體的克隆操作要比質(zhì)粒載體復(fù)雜。

如果將左右臂和中段都去除，僅留下λDNA而端包裝噬菌體所必需的cos序列，再加上質(zhì)粒的復(fù)制序列、標(biāo)志基因、多克隆位點(diǎn)等，就可構(gòu)成cos質(zhì)?；蚍Q為粘粒的載體。粘粒可插入45kb長的外源DNA，然后用λ噬菌體外殼蛋白包裝成噬菌體，感染大腸桿菌后，粘粒的DNA能以質(zhì)粒的形式在細(xì)菌中繁殖而被克隆。所以粘粒主要用于DNA文庫的構(gòu)建。