基因文庫
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中文名稱： 基因文庫
英文名稱： gene library
學(xué)科分類： 遺傳學(xué)
注 釋： 一個(gè)生物體的基因組DNA用限制性內(nèi)切酶部分酶切后，將酶切片段插入到載體DNA分子中，所有這些插入了基因組DNA片段的載體分子的集合體，將包含這個(gè)生物體的整個(gè)基因組，也就是構(gòu)成了這個(gè)生物體的基因文庫。
將這些載體導(dǎo)入到受體細(xì)菌或細(xì)胞中，這樣每個(gè)細(xì)胞就包含了一個(gè)基因組DNA片段與載體重組DNA分子，經(jīng)過繁殖擴(kuò)增， 許多細(xì)胞一起包含了該生物全部基因組序列，我們將這一個(gè)集合體叫做基因文庫。
用重組DNA技術(shù)將某種生物細(xì)胞的總DNA 或染色體DNA的所有片斷隨機(jī)地連接到基因載體上,然后轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)?a href="/w/%E5%AE%BF%E4%B8%BB" title="宿主">宿主細(xì)胞中，通過細(xì)胞增殖而構(gòu)成各個(gè)片段的無性繁殖系（克?。?，在制備的克隆數(shù)目多到可以把某種生物的全部基因都包含在內(nèi)的情況下，這一組克隆的總體就被稱為某種生物的基因文庫。同一定義也適用于某種生物的線粒體DNA或葉綠體DNA的基因文庫。由于制備DNA片段的切點(diǎn)是隨機(jī)的，所以每一克隆內(nèi)所含的 DNA片段既可能是一個(gè)或幾個(gè)基因，也可能是一個(gè)基因的一部分或除完整基因外還包含著兩側(cè)的鄰近DNA順序?！ ?/p>
目錄 |
基因文庫與基因庫的區(qū)別
基因文庫與基因庫的概念不同。基因庫是指某一生物群體中的全部基因?；蛭膸炫c基因克隆的概念也有區(qū)別，基因克隆是只包含某些特定基因或 DNA片段的克隆。基因文庫中包含著為數(shù)眾多的克隆，建成后可供隨時(shí)選取其中任何一個(gè)基因克隆之用。
基因文庫的建立和使用是70年代早期重組DNA技術(shù)的一個(gè)發(fā)展。人們?yōu)榱朔蛛x基因，特別是分離真核生物的基因，從1974年起相繼建立了大腸桿菌、酵母菌、果蠅、雞、兔、小鼠、人、大豆等生物以及一些生物的線粒體和葉綠體 DNA的基因文庫。基因文庫的建立使分子遺傳學(xué)和遺傳工程的研究進(jìn)入了一個(gè)新時(shí)期?！ ?/p>
基因文庫的建立
一個(gè)基因文庫中應(yīng)包含的克隆數(shù)目與該生物的基因組的大小和被克隆 DNA片段的長(zhǎng)度有關(guān)。原核生物的基因組較小，需要的克隆數(shù)也較少；真核生物的基因組較大，克隆數(shù)需相應(yīng)增加，才能包含所有的基因。此外，每一載體DNA中所允許插入的外源DNA片段的長(zhǎng)度較大，則所需總克隆數(shù)越少；反之則所需數(shù)越多。如果一個(gè)基因文庫的總克隆數(shù)較少，則從中篩選基因雖然比較容易，但給以后的分析造成困難，因?yàn)槠蔚拈L(zhǎng)度增加了。如果要使每一克隆中的 DNA片段縮短，就須增加克隆數(shù)，所以在建立基因文庫前應(yīng)根據(jù)研究目的來確定 DNA片段的長(zhǎng)度和克隆的數(shù)目。L.克拉克和J.卡邦在1975年提出一個(gè)統(tǒng)計(jì)學(xué)的公式來計(jì)算某一基因文庫中所應(yīng)包含的克隆數(shù)目。在建立基因文庫時(shí)，任何一個(gè)DNA片段都是在隨機(jī)的基礎(chǔ)上被克隆的。在公式
中，P 是從建成的基因文庫中可能選出某一基因的概率，這一數(shù)字由工作者根據(jù)需要選定。? 是該基因文庫中每一克隆所含外源 DNA片段的平均長(zhǎng)度，可根據(jù)該生物基因組大小和所用載體可容納的外源 DNA片段的長(zhǎng)度決定。G是該生物基因組的大小，基因組大小和DNA片段長(zhǎng)度的單位可用道爾頓或堿基對(duì)表示。N 是這一基因文庫所應(yīng)包含的克隆數(shù)目。在制備某一哺乳動(dòng)物基因文庫時(shí),假若選出某一基因的概率定為99％,每一克隆內(nèi)所含外源DNA片段的平均長(zhǎng)度是2×104堿基對(duì),基因組大小是3×109堿基對(duì)，則
基因組大小及片段等之間的關(guān)系
下表中表示基因組大小(G)、片段大小(?)、出選某基因的概率(p)與總克隆數(shù)(N)四者之間的關(guān)系。
產(chǎn)生 DNA片段的方法要求切點(diǎn)隨機(jī)性高，使任一基因都可能被完整地克隆，并且最好在兩側(cè)都留有粘性末端以利于 DNA片段間的連接。機(jī)械剪切方法的優(yōu)點(diǎn)是隨機(jī)性高，可是所得片段兩端沒有粘性末端，有時(shí)較為不便與載體連接。用限制性核酸內(nèi)切酶酶解的隨機(jī)性較差，但是兩端有粘性末端,便于和載體相連接（見重組DNA技術(shù)）。
基因載體通常根據(jù)待克隆的 DNA片段長(zhǎng)度來選擇。在制作原核生物基因文庫時(shí)，因基因組較小，可把 DNA片段切得短些，可選用質(zhì)粒如pBR322等作載體。真核生物的基因內(nèi)部常有稱為內(nèi)含子的非編碼區(qū)，使一個(gè)天然基因的長(zhǎng)度比實(shí)際編碼的部分要長(zhǎng)得多，基因文庫中待克隆的 DNA片段便應(yīng)長(zhǎng)些，以保證得到完整的基因。通常采用的載體有經(jīng)過改建的噬菌體如λCharon4A（長(zhǎng)度462kb，可克隆外源DNA長(zhǎng)度 8.2～22.2kb）和粘性質(zhì)粒(例如pHC79，長(zhǎng)度6.4kb,可容納外源DNA長(zhǎng)度37～50kb)等。
經(jīng)剪切得到的 DNA片段可通過噬菌體T4連接酶或大腸桿菌連接酶與載體DNA共價(jià)連接，使成為雜種DNA分子。
用質(zhì)粒作為載體的重組 DNA分子可以通過轉(zhuǎn)化引進(jìn)細(xì)胞。用λ噬菌體的 DNA作載體的重組分子直接經(jīng)轉(zhuǎn)染引入細(xì)胞的效率較低；一般需先行離體包裝，即把重組DNA分子包在噬菌體外殼中,再通過噬菌體感染而把重組DNA 分子引入敏感細(xì)菌細(xì)胞中。它的效率比轉(zhuǎn)染高出幾十到幾百倍?！ ?/p>
基因文庫的保存
為了有效地保存基因文庫，可通過細(xì)菌的繁殖而使包含各個(gè)特定 DNA片段的細(xì)菌增多。液體培養(yǎng)不適用于這一目的，因?yàn)楦鱾€(gè)細(xì)菌的生存和繁殖能力不同，各個(gè)克隆被保存的機(jī)會(huì)也會(huì)因此而不相等。在固體培養(yǎng)基上每一個(gè)細(xì)菌單獨(dú)形成一個(gè)菌落，各個(gè)細(xì)菌并不相互干擾和競(jìng)爭(zhēng)，因而有利于全部克隆的保存。形成的每一個(gè)菌落中大約包含107個(gè)細(xì)菌，這樣一個(gè)基因文庫中的所有的克隆幾乎都擴(kuò)增了107倍。把培養(yǎng)皿上的細(xì)菌全部洗下加以保存，便可以在需要時(shí)從中取得任何一個(gè)克隆?！ ?/p>
基因文庫的利用
從基因文庫中篩選某一克隆的常用辦法是分子雜交。首先把屬于一個(gè)文庫的細(xì)菌或噬菌體以較低密度接種在培養(yǎng)皿上以取得相當(dāng)分散的菌落或噬菌斑，然后用硝酸纖維濾膜吸印，使培養(yǎng)皿和濾膜的相對(duì)應(yīng)的位置上具有相同的克隆。同時(shí)另行制備供分子雜交用的探針。為了篩選真核生物的某種基因，常從它的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA經(jīng)反向轉(zhuǎn)錄（見中心法則）合成相應(yīng)的互補(bǔ) DNA(cDNA)，再加入用32P標(biāo)記的核苷三磷酸，用DNA多聚酶I切口移位方法制成有同位素標(biāo)記的探針。把探針 DNA和硝酸纖維濾膜上的菌落或噬菌體分別進(jìn)行變性處理，然后進(jìn)行分子雜交。再將 X光底片覆蓋在經(jīng)過處理的濾膜上以進(jìn)行放射自顯影。在培養(yǎng)皿上找出和 X光底片上的黑點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的菌落或噬菌斑，這些菌落或噬菌體中便包含著所需要的基因。經(jīng)過擴(kuò)增便能得到大量的細(xì)菌或噬菌體，從中可以分離出所需基因的DNA片段?！ ?/p>
基因文庫的應(yīng)用
建立和使用基因文庫是分離基因，特別是分離高等真核生物基因的有效手段。如果一個(gè)哺乳動(dòng)物的基因組是 3×109堿基對(duì)，直接從細(xì)胞中提取并分離出某一特定基因的 DNA片段在技術(shù)上是很困難的。但是在基因文庫中，不同的 DNA片段都分別在不同的克隆中擴(kuò)增了，只要有該基因的探針存在，則從許多克隆中篩選一個(gè)所需的克隆是一項(xiàng)比較簡(jiǎn)單的工作。此外基因文庫中被克隆的 DNA都是基因組中各種隨機(jī)的順序片段，某些 DNA片段還包括基因外部的鄰近的甚至互相跨疊的序列，所以基因文庫特別有利于研究天然狀態(tài)下基因的順序組織。例如曾從人的基因文庫中分離得到含有血紅蛋白 β鏈基因的克隆，從中取得該基因的DNA并進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)人的δ和β鏈基因是連鎖的，二者之間相隔幾千個(gè)堿基對(duì)，而且在它們內(nèi)部都有兩個(gè)內(nèi)含子。
基因文庫還可以應(yīng)用在個(gè)體發(fā)育的研究中。例如從芽孢桿菌的正在形成芽孢的菌體中分離mRNA，并用同位素標(biāo)記做成探針，用這些探針可以從芽孢桿菌的基因文庫中分離出只在芽孢形成過程中活動(dòng)的基因，有助于對(duì)發(fā)育過程中基因調(diào)控進(jìn)行研究。
基因文庫也可以應(yīng)用在高等生物，例如人的基因定位工作中。基因文庫在生產(chǎn)實(shí)際中也是取得所需要的基因的一種重要方法。
基因文庫的背景
基因文庫有關(guān)技術(shù)的建立及應(yīng)用雖然只有幾年歷史，但是它作為重組DNA技術(shù)應(yīng)用的一個(gè)重要方面已經(jīng)顯示了它在解決分子遺傳學(xué)中的理論問題和遺傳工程中的實(shí)際問題上的巨大潛力。
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